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本制品是一种检测人类男性Y染色体浓度的实时荧光定量PCR试剂盒，包括精心优化的PCR反应液、引物混合物、标准品，尤其适用于珍贵、微量DNA样本的定量检测。试剂盒采用了全新高效、快速的热启动扩增酶BaldStar Taq DNA Polymerase，有效避免常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增。本制品实现对Y染色体的准确定量，后续可应用于各种领域如遗传制图、物种多态性研究、疾病基因定位、亲子鉴定和法医鉴定等研究分析。

• 不需要ROX校正的仪器：Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-radiCyler iQ，iQ5，CFX96等。
  
• 需要Low ROX校正的仪器：ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio 3 System，QuantStudio 5 System，QuantStudio 6 Flex System，QuantStudio 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
  
• 需要High ROX校正的仪器：ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

• 在试验前，应详细阅读本说明。应由具备专业经验或经培训合格的人员进行操作。
  
• 使用请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
  
• 避免反复冻融本制品，反复冻融可能使产品性能下降。
  
• 配制反应液时，请使用新的或者无污染的枪头和离心管，尽量防止污染。

• 扩增模板准备
  将待检测文库样品用TE（10mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA）稀释，稀释后浓度尽量在0.05～10ng/μL之间。4℃冰上放置备用。
  
• 标准品稀释：按照下表，先将Human DNA Standard（100ng/uL）用TE按下表稀释出5个不同浓度的标准品。10ng/μL的DNA Standard 1（Std.1）可在-20℃稳定保存1个月；Std2-5只能当天使用，配好后暂时不用时应4℃或冰上放置。
  

  标样	对应浓度(ng/μl)	最小稀释体积（单位：μl）
  Std.1	10	10 [100ng/μl DNA Standard]+ 90 TE
  Std.2	2.5	20 [Std.1] +60 TE
  Std.3	0.625	20 [Std.2] +60 TE
  Std.4	0.15625	20 [Std.3] +60 TE
  Std.5	0.0390625	20 [Std.4] +60 TE

• qPCR反应体系配制
  配制前预先将所需要用到的冷冻保存的试剂完全融化并多次颠倒混匀，然后短暂离心后备用。标准品和模板按照上面所述的方法稀释后备用。20μL的基础反应体系如下：
  

  成分	用量
  2×BaldStar Probe Mixture	10μL
  Probe Primer Mix	3μL
  Template	4μL
  ddH2O	3μL

  注意：
  High ROX机型：每50μL反应体系加入1μL 50×High ROX；
  Low ROX机型：每500μL反应体系加入1μL50×High ROX。
  根据需要配出足够量的反应体系混合物，反应体系配完并充分混匀后，按每孔16μL体积加入反应孔中。然后将准备好的标准品及稀释好的样品加入对应反应孔，加入量为4μL/孔。空白对照管中加入TE，同样加入量为4μL/孔。
  推荐使用20μL反应，如需进行更小体系反应，将体系各组分等比减少即可。
  
• qPCR反应程序
  本试剂盒的PCR mix含目的基因的FAM荧光探针和内参照Internal PCR Control (IPC)的VIC荧光探针，检测时需要选择水解探针双荧光的qPCR程序。请根据所用仪器说明进行设定。PCR反应温度条件如下：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	10min	1
  变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec

• 标准曲线制作
  参照数据处理Excel表绘制标准曲线。标准曲线相关系数R2应不低于0.98，以Ct值为纵坐标时，斜率应位于-3.1与-3.6之间，如标准曲线参数不合理，建议重复实验。
  

  DNA Standard名称	DNA Standard浓度（ng/μL）
  DNA Standard 1	10
  DNA Standard 2	2.5
  DNA Standard 3	0.625
  DNA Standard 4	0.15625
  DNA Standard 5	0.0390625

  
  
• 结果分析及浓度计算
  目的基因FAM信号的实验复孔间的Ct差异应不超过0.3，否则需删除无效数据或重复实验，请勿使用标准曲线有效Ct范围外的Ct计算样品的浓度。具体计算方法请参见本制品的数据处理Excel。
  若FAM信号不正常，需分析内参照Internal PCR Control (IPC)的VIC信号，确认PCR反应过程是否异常。若样品空VIC的Ct值显著大于标准品或空白对照孔，说明样品对PCR反应有抑制。